Gen klónun er athöfnin að búa til afrit eða klón, af einni geni. Þegar gen er skilgreint má nota klóna á mörgum sviðum líffræðilegrar og iðnaðar rannsókna. Erfðafræði er aðferðin við að klóna gena í nýjar lífverur eða breyta DNA röðinni til að breyta próteinafurðinni. Erfðafræði fer eftir getu okkar til að framkvæma eftirfarandi grundvallaraðgerðir.
01 Polymerase Chain Reaction
02 takmarkanir ensím
Uppgötvun ensíma þekkt sem endonukleasa í takmarkanir hefur verið nauðsynleg fyrir próteinverkfræði . Þessi ensím skera DNA á ákveðnum stöðum byggð á núkleótíð röðinni. Hundruð mismunandi hindrunar ensím , sem geta skorið DNA á sérstökum stað, hafa verið einangruð frá mörgum mismunandi bakteríustofnunum. DNA skera með takmörkun ensím framleiðir margar smærri brot, af mismunandi stærðum. Þessar geta verið aðskildir með því að nota rafgreiningu rafskauts eða litskiljun.
03 rafgreining
Að hreinsa DNA úr frumurækt eða skera það með takmörkun ensímum myndi ekki vera mikið notað ef við gætum ekki sýnt DNAið - það er að finna leið til að sjá hvort þykknið inniheldur eitthvað eða ekki Ég skera það inn. Ein leið til að gera þetta er með rafgreiningu á hlaupi. Gels eru notaðar til ýmissa nota, frá því að skoða skera DNA til að greina DNA-innskot og knockouts.
04 Taka þátt tvö stykki af DNA
Í erfðafræðilegum rannsóknum er oft nauðsynlegt að tengja tvö eða fleiri einstaka þætti DNA, til að búa til raðbrigða streng eða loka hringlaga strand sem hefur verið skorið með takmörkun ensímum. Ensím sem kallast DNA ligasar geta skapað samgildar bindingar milli núkleótíðkeðjanna. Ensím DNA pólýmerasa I og fjölkirnis kínasa eru einnig mikilvægar í þessu ferli, til að fylla í eyður eða fosfórýma 5'endanna, í sömu röð.
05 Val á lítilli sjálfskiptunar DNA
Lítil, hringlaga stykki af DNA sem eru ekki hluti af bakteríusegamfrumu, en eru fær um sjálfsafritun, eru þekkt sem plasmíð. Plasmíð eru oft notuð sem vektorar til að flytja gen á milli örvera. Í líftækni, þegar genið sem hefur áhuga hefur verið magnað og bæði genið og plasmíðið er skorið með takmörkun ensímum, eru þau bundin saman og mynda það sem þekkt er sem raðbrigða DNA. Veiru (bakteríufag) DNA er einnig hægt að nota sem vigur, eins og getur kosmíð, raðbrigða plasmíð sem innihalda bakteríufag gen.
06 Aðferð til að færa vigur í hýsilfrumu
Ferlið við að flytja erfðaefni á vigur eins og plasmíð, inn í nýtt hýsilfrumur, er kallað umbreyting. Þessi aðferð krefst þess að hýsilfrumurnar verða fyrir umhverfisbreytingum sem gerir þeim "hæfileika" eða tímabundið gegndræpi vigranna. Electroporation er ein slík tækni. Því stærri plasmíðið, því lægra skilvirkni sem það er tekið upp af frumum. Stærri DNA hluti eru auðveldara að klóna með því að nota bakteríophage, retrovirus eða aðrar veiruvektar eða cosmids í aðferð sem kallast transduction. Phage- eða veiruveirur eru oft notaðir við endurnýjanleg lyf en geta valdið því að DNA sé sett í hluta litbrigða okkar þar sem við viljum ekki það, sem veldur fylgikvillum og jafnvel krabbameini.
07 Aðferðir til að velja transgena líffæri
Ekki munu allir frumur taka DNA í umbreytingu. Það er nauðsynlegt að það sé aðferð til að greina þá sem gera. Venjulega bera plasmíð gen til sýklalyfjameðferðar og hægt er að velja transgena frumur á grundvelli tjáningar þessara gena og getu þeirra til að vaxa á fjölmiðlum sem innihalda þessi sýklalyf. Önnur aðferðir við valið eru háð nærveru annarra blaðamyndapróteina eins og x-gal / lacZ kerfið eða grænt flúrljómunprótein, sem gerir kleift að velja á grundvelli lit og flúrljómun, í sömu röð.