Hvaða PCR hefur að gera með DNA sequencing og amplification Genes
Pólýmerasa keðjuverkunin ( PCR ) er sameinda erfðafræðileg aðferð til að búa til margar eintök af geni og er einnig hluti af erfðunarferlinu.
Hvernig virkar Polymerase keðjuverkun?
Gen afrit eru gerðar með því að nota sýnishorn af DNA, og tæknin er nægjanleg til að gera margar eintök af einum eintak af geninu sem finnast í sýninu. PCR mögnun gena til að búa til milljón eintaka, gerir kleift að greina og bera kennsl á genaröð með því að nota sjónaraðferðir byggðar á stærð og hleðslu (+ eða -) af DNA-hlutanum.
Við stýrð skilyrði myndast litlar hluti DNA af ensímum sem eru þekktar sem DNA polymerasar, sem bætir ókeypis deoxynukleotíðum (dNTPs) við stykki af DNA sem kallast "sniðmátið". Jafnvel minni stykki af DNA, sem kallast "primers", eru notuð sem upphafspunktur fyrir fjölliðuna. Grunnur er lítill, mannafnaður stykki af DNA (oligomers), venjulega á milli 15 og 30 núkleótíða langur. Þeir eru gerðar með því að vita eða giska á stuttar DNA raðir við endann á geninu sem magnast. Á PCR, DNA sem er röðin er hituð og tvöfalda strengir aðskilja. Við kælingu binda grunnarnir við sniðmátið (kallað glæðiefni) og búa til stað þar sem fjölliðan hefst.
PCR tækni
Pólýmerasa keðjuverkunin (PCR) var gerð möguleg með uppgötvun hitafælna og hitabætandi fjölliða ensím (ensím sem viðhalda uppbyggingu og virkni eftir hita við háan hita).
Skrefin sem taka þátt í PCR tækni eru sem hér segir:
- Blanda er búið til, með bjartsýni styrkleika DNA sniðmát, fjölliða ensím, frumur og dNTPs. Hæfni til að hita blönduna án þess að denita ensímið gerir ráð fyrir denitun tvöfalda helix DNA sýnis við hitastig á bilinu 94 gráður á Celsíus.
- Eftir denitun er kældin kæld í meira meðallagi, um það bil 54 gráður, sem auðveldar glæðingu (bindingu) frumna að einstrengdu DNA sniðmátunum.
- Í þriðja þrepi hringrásarinnar er sýnið endurhitað í 72 gráður, hið fullkomna hitastig fyrir Taq DNA Polymerase, til lengingar. Meðan á lengingu stendur, notar DNA pólýmerasa upprunalegu einum streng DNA sem sniðmát til að bæta viðbótar dNTP við 3'enda endanna af hverjum grunni og mynda hluta tvöfaltstrengið DNA á svæðinu af því geni sem vekur áhuga.
- Grunur sem hefur verið glæpaður við DNA raðir sem eru ekki nákvæmar samsvörun halda ekki áfram í 72 gráður, þannig að takmarka lengingu við genið sem vekur áhuga.
Þetta ferli við denitun, glæðingu og lengingu er endurtekið margfeldi (30-40) sinnum og þar með aukið veldishraða fjölda eintaka af viðkomandi geni í blöndunni. Þó að þetta ferli væri frekar leiðinlegt ef það er gert handvirkt, er hægt að framleiða sýni og ræktuð í forritanlegu hitamælir, sem er nú algeng í flestum sameindalíffræðilegum rannsóknarstofum og hægt er að framkvæma heildar PCR viðbrögð á 3-4 klukkustundum.
Hvert denitunarstig hættir lengingartímabilinu í fyrri hringrásinni og dregur þannig úr nýju DNA-strengnum og geymir það um það bil stærð viðkomandi gen.
Lengd lengingartímabilsins er hægt að gera lengur eða styttri eftir stærð gensins sem vekur áhuga, en að lokum með endurteknum lotum PCR mun meirihluti sniðmát takmarkast við stærð gensins sem vekur áhuga einn, eins og þau mun hafa myndast af vörum frá báðum primers.
Það eru nokkrir mismunandi þættir fyrir árangursríka PCR sem hægt er að nota til að auka árangur. Mest notaður aðferð til að prófa fyrir nærveru PCR vara er agarósa hlaup rafskaut . Sem er notað til að aðskilja DNA brot á grundvelli stærð og hleðslu. Brotin eru síðan sýnd með litarefni eða geislameðferð.
Þróunin
Frá uppgötvun PCR hafa DNA-fjölliður, önnur en upprunalega Taq, fundist. Sumir þessir hafa betri getu til að prófa "prófun" eða eru stöðugri við hærra hitastig, þannig að auka sértækni PCR og draga úr villum frá innsetningu rangra dNTP.
Sumar afbrigði af PCR hafa verið hönnuð fyrir tilteknar umsóknir og eru nú notuð reglulega í sameindalæknarannsóknarstofum. Sumir þessara eru PCR í rauntíma og PCR við endurrita. Uppgötvun PCR hefur einnig leitt til þróunar á DNA raðgreiningu, DNA fingrafar og öðrum sameindatækni.