Leiðréttingar á einhverjum þáttum í fjölmerasa keðjuverkun (PCR) geta breytt gæðum niðurstaðna, annaðhvort með því að bæta eða minnka afrakstur og gæði vöru eða með því að bæta viðkvæmni og næmi. Breytur sem hafa áhrif á niðurstaðan getur verið annaðhvort líkamlegt (þ.e. hitastig, hringrásartímar) eða efnafræðilegir (þ.e. styrkleiki mótsins, tegund ensíms sem notuð er). Eftirfarandi eru nokkrir lykilþættir sem hafa áhrif á árangur PCR.
01 Hreint rannsóknarstofa
Þar sem PCR er fær um að greina eina sameind DNA, er mikilvægt að viðhalda óspilltum skilyrðum á rannsóknarstofunni. Notið alltaf nýjar hanskar, notaðu sæfðu glervörur, rör og pípettu og sæfða lausn og hreinsaðu vinnusvæðið áður en þú byrjar að vinna.
Taktu alltaf eftirlit með viðbrögðum án DNA-sniðmáls og án ensíms til þess að tryggja að niðurstöðurnar séu sannarlega vegna mælingar á réttu sýninu.
Flestir eru viss um að hafa sitt eigið sett af lausnum sem ekki eru deilt til að gera vandræða auðveldara og tilnefndir pipettur eru settar til hliðar fyrir PCR eingöngu. DNase og RNase-frjáls PCR rör, úðabrúsaþolnir pípettútsagnir og vinna í gufubúnaði með UV-ljósi eru einnig leiðir til að draga úr vandamálum.
02 efnafræðilegir hlutir
- Hafa 18 til 24 bækistöðvar
- Hafa ekki neina efri uppbyggingu (þ.e. hairpin lykkjur)
- Hafa jafna dreifingu G / C og A / T pör
- Eru ekki viðbót við hvert annað við 3 feta enda
- Hafa bræðslumark (Tm) um 5-10 gráður Celcius undir glæðihita, sem er venjulega á milli 55 og 65 gráður Celcius
Tm fyrir báðar prímurnar ætti einnig að vera svipuð til að ná bestum árangri.
03 Reaction Mix: Snið og grunnur
Góðan grunnþéttni er milli 0,1 og 0,6 míkrómól / L. Magnið af sniðmát er mismunandi eftir tegund DNA (manna, baktería, plasmíð).
Með mjög lítið magn af sniðmáti eru aðrar aðferðir til að bæta árangur, eins og aukin hringrásarnúmer eða notkun "heitt byrja". Prófaðu alltaf nýjar prímar með jákvæðri viðbrögðum, til að tryggja að þau virka undir sérstökum tilraunum.
04 Reaction Mix: Enzyme Activity
Styrkur MgCl2 í hvarfblandunni getur haft áhrif á PCR niðurstöðu og gæti gegnt mikilvægu hlutverki við fleiri viðvarandi viðbrögð. Magnesíumkatjón myndar leysanlegar fléttur með dNTPs til að framleiða raunverulegt hvarfefni sem fjölliðunarensímið viðurkennir.
Jöfn magn allra fjóra dNTPs hjálpar einnig að draga úr fjölliðunarvillunni. Ákveðnar aukefni eins og betaín, BSA, hreinsiefni, DMSO, glýseról og pýrófosfatasi geta einnig haft áhrif á ensímsértækni eða virkni viðbrögð.
05 Tegund hitafælis
Þegar búið er að versla fyrir rannsóknarstofu, hafðu í huga að sumir hitaþolfar eru minna nákvæmar en aðrir við að viðhalda nákvæmum, óskaðri hitastigi.
Þetta er eitt svæði þar sem ódýrt mun ekki borga til lengri tíma litið þegar þú ert frammi fyrir fíngerðum viðbrögðum eða með því að nota prímur sem krefjast þröngt úrval af annealing hita.
Thin-walled viðbrögð rör sem hönnuð eru til að passa nákvæm tegund af thermocycler þú ert að nota, einnig hjálpa bjartsýni viðbrögð hitastig.
06 Hringrásarstillingar
Aukin ávöxtun er hægt að ná með því að auka framlengingartímann um hvert 20 lotur, til að bæta fyrir minna ensím til að magna fleiri sniðmát. Venjulega eru minna en 40 lotur nægjanlegar til að magna minna en 10 sniðmátarsameindir í styrk sem er nógu stór til að skoða á etidíumbrómíð litaða agarósa hlaup .