Hve miklu leyti próteinhreinleiki sem krafist er veltur á fyrirhuguðum endanotkun próteinsins.
Fyrir sum forrit er óhófleg útdráttur nægjanlegur. Hins vegar, til annarra nota, svo sem í matvælum og lyfjum, er mikil hreinleiki krafist. Til að ná þessum nokkrum próteinhreinsunaraðferðum eru venjulega notuð, í röð hreinsunarstíga.
Hvert próteinhreinsunartæki leiðir yfirleitt í sumum vöruflokki. Því er tilvalin próteinhreinsunaráætlun ein þar sem hæsta stig hreinsunar er náð í fæstu skrefunum. Val á hvaða skrefum sem nota á er háð stærð, hleðslu, leysni og öðrum eiginleikum markpróteinsins. Eftirfarandi aðferðir eru hentugastir til að hreinsa eitt frumudrepandi prótein. Hreinsun frumudrepandi próteina flókna er flóknara og krefst venjulega að mismunandi aðferðir séu notaðar.
Fyrstu skref fyrir próteinhreinsun
Fyrsta skrefið í hreinsun innanfrumna ( innanfrumu ) próteina er að framleiða óhreinsaða þykkni .
Útdrátturinn mun innihalda flókin blöndu af öllum próteinum úr frumufrumum og nokkrum viðbótarumhverfum, köflum og næringarefnum. Hráolíuþykknið er heimilt að nota í sumum forritum í líftækni, en ef hreinleiki er mál verður að fylgjast með síðari hreinsunarstíðum.
Hráprótín útdrættir eru unnin með því að fjarlægja frumuskemmdir sem myndast við frumuljós, sem er náð með því að nota efni og ensím , hljóðritun eða franskan frétt. Ruslið er fjarlægt með miðflæði, og flotið er endurheimt. Hráefni af utanfrumuprótínum má fá með því einfaldlega að fjarlægja frumurnar með skilvindu.
Fyrir tilteknar líftækniforrit eru eftirspurn eftir hitastable ensímum : ensím sem geta þolað háan hita án þess að denita og viðhalda mikilli sérhæfða virkni. Líffræðingar sem framleiða þau eru stundum kallað extremophiles. Einföld nálgun við að hreinsa hitaþolið prótein er að hnýta hina aðra próteinin í blöndunni með því að hita, þá kæla lausnina (þannig að hitastigseiningin geti umbreytt eða enduruppleyst, ef nauðsyn krefur. Þá er hægt að fjarlægja eðlilega próteinið með miðflæði.
Milliefni hreinsunarþrep
Í fortíðinni var algengt annað skref til að hreinsa prótein úr hráu þykkni með útfellingu í lausn með mikilli osmósstyrk (þ.e. saltlausnir). Nukleinsýrur í hráu útdrættinum er hægt að fjarlægja með því að útfella samanlagðir sem myndast með streptómýsínsúlfati eða prótamínsúlfati.
Próteinútfelling er venjulega gert með því að nota ammóníumsúlfat sem saltið.
Mismunandi prótein munu botnfallast í mismunandi styrkum ammóníumsúlfats . Almennt eru prótein með hærri mólþunga botnfall í lægri styrk ammóníumsúlfats. Salt úrkomu leiðir yfirleitt ekki til mjög hreinsaðs próteins en getur hjálpað til við að útiloka nokkrar óæskilegar prótein í blöndu og einbeita sýninu. Sölt í lausninni er síðan fjarlægt með skilun með porous sellulósa rör, síun eða hlaup útilokun litskiljun.
Nútíma líftækni siðareglur nýta sér oft mörg viðskiptatækin pökkum sem bjóða upp á tilbúnar lausnir fyrir venjulegar aðferðir. Próteinhreinsun er oft framkvæmd með því að nota síur og tilbúnar gelsíunarsúlur. Allt sem þú þarft að gera er að fylgja leiðbeiningunum og bæta réttu magni af réttu lausninni og bíða eftir tilgreindan tíma meðan þú safnar skoluninni (sem kemur út í aðra enda dálksins) í nýjum prófunarrör.
- Hægt er að beita krómatískum aðferðum með beinni toppsúlum eða sjálfvirkri HPLC búnaði. Aðskilnaður með HPLC er hægt að gera með andstæða fasa, jónaskiptum eða stærðútilokunaraðferðum og sýnum sem finnast með díóða array eða leysitækni. To
Próteinmyndun og mat á hreinsun
- Afturfasa litskiljun (RPC) skilur prótein miðað við hlutfallslega vatnsfælni þeirra . Þessi tækni er mjög sértækur en krefst notkunar lífrænna leysiefna. Sum prótein eru endurnýjanleg með leysiefni og missa virkni meðan á RPC stendur. Þess vegna er ekki mælt með þessum aðferðum við öll forrit, sérstaklega ef nauðsynlegt er að markpróteinið haldi virkni.
- Jónaskipti litskiljun vísar til aðskilnaðar próteina miðað við hleðslu . Dálkar geta annaðhvort verið búnar til fyrir anjónaskipti eða katjónaskipti. Anion skiptisúlur innihalda kyrrstöðu fasa með jákvæða hleðslu sem dregur neikvætt hlaðin prótein. Kationaskiptasúlur eru andstæða, neikvætt hlaðnar perlur sem laða að jákvæðu hleðslupróteinum. Eimingu markpróteinsins er gert með því að breyta pH í dálknum, sem leiðir til breytinga eða hlutleysingar á hinni hreinsuðu virku hópunum í hverju próteini.
- Stærð-útilokun litskiljun ( gelsíun ) skilur stærri prótein frá litlum þar sem stærri sameindirnar ferðast hraðar gegnum krossbundna fjölliðuna í litskiljunarsúlunni. Stóra prótein passa ekki inn í svitahola fjölliðunnar, en minni prótein gera og taka lengri tíma að ferðast í gegnum litskiljunarsúluna, með minna beinni leið. Eluat er safnað í röð af rörum sem skilja prótein miðað við elúeringartíma. Gelsíun er gagnlegt tól til að einbeita sér próteinssýni þar sem markpróteinið er safnað í minni elúunarrúmmáli en upphaflega bætt við súlunni. Svipaðar síunaraðferðir gætu verið notaðar við stórum próteinframleiðslu vegna kostnaðarhagkvæmni þeirra.
- Affinity litskiljun er mjög gagnlegur tækni til að "fægja" eða ljúka próteinhreinsunarferlinu. Perlur í litskiljunarsúlunni eru krossbundin við bindiefni sem bindast sérstaklega við markpróteinið. Próteinið er síðan fjarlægt úr súlunni með því að skola með lausn sem inniheldur frjálsa bindla. Þessi aðferð gefur hreinustu niðurstöður og hæsta tiltekna virkni samanborið við aðrar aðferðir.
- SDS-PAGE er polyacrylamide gel electrophoresis, framkvæmt í viðurvist SDS (natríumdodecyl súlfat) sem binst próteinum sem gefur þeim stóran nettó neikvæða hleðslu. Þar sem gjöld allra próteina eru nokkuð jafnir, þá skilur þessi aðferð þá næstum eingöngu á grundvelli stærð. SDS-PAGE er oft notað til að prófa hreinleika próteina eftir hvert skref í röð. Eins og óæskileg prótein eru smám saman fjarlægð úr blöndunni er fjöldi hljómsveita sem sýndar eru á SDS-PAGE hlaupinu minnkað þar til aðeins eitt band er fyrir hendi af viðkomandi próteini.
- Ónæmisbrestur er próteinstillingaraðferð sem beitt er í sambandi við sækni litskiljun. Mótefni fyrir tiltekið prótein eru notuð sem bindlar á sækni litskiljunarsúlu. Markmiðprótínið er haldið á súlunni, síðan fjarlægt með því að skola súluna með saltlausn eða öðrum efnum. Mótefni tengd geislavirkum eða litarefnalyfjum aðstoða við að greina markpróteinið þegar það er aðskilið frá restinni af blöndunni.
Heimildir:
Zubay G. 1988. Lífefnafræði, 2. útgáfa. Macmillan Publishing Co, New York, NY, USA.
Amersham Pharmacia Biotech. 1999. Próteinhreinsunarhandbók, útgáfa AB. Amersham Pharmacia Biotech Inc. New Jersey, Bandaríkjunum. http://www.biochem.uiowa.edu/donelson/Database%20items/protein_purification_handbook.pdf.