DNA raðgreining er einnig háð getu okkar til að nota rafgreiningu á hlaupi til að aðskilja þætti DNA sem eru mismunandi í stærð með eins litlu og einum grunnpöru.
DNA sequencing
Í lok 1970 voru tvær DNA raðgreiningartækni fyrir lengri DNA sameindir fundin upp. Þetta voru Sanger (eða dídeoxý) aðferðin og Maxam-Gilbert (efnafræðileg klofning) aðferðin. Maxam-Gilbert aðferðin byggist á núkleótíðgreindri klæðingu með efnum og er best notaður til að raða oligonucleotides (stuttir núkleótíðfjölliður, venjulega minni en 50 basa pör að lengd). Sanger aðferðin er algengari vegna þess að það hefur verið sannað tæknilega auðveldara að sækja um, og með tilkomu PCR og sjálfvirkni tækni er auðvelt að beita á löngum þræðum DNA, þ.mt nokkrar heilar genir. Þessi tækni byggist á lokun tíðni dídexíðkimída við PCR tíðni viðbrögð.
Sanger Method
Í Sanger-aðferðinni er DNA-strengurinn sem á að greina er notaður sem sniðmát og DNA-pólýmerasa er notað, í PCR-viðbrögðum, til að búa til ókeypis strengi með því að nota prímar.
Fjórir mismunandi PCR hvarfblöndur eru framleiddar, hver inniheldur ákveðinn hundraðshluta dideoxýnuklefíðtíffosfat (ddNTP) hliðstæða við einn af fjórum núkleótíðum (ATP, CTP, GTP eða TTP). Samsetning nýrrar DNA strandar heldur áfram þar til einn af þessum hliðstæðum er felld inn, þar sem strengurinn er tímabundið styttur.
Hver PCR viðbrögð mun endar innihalda blöndu af mismunandi lengdum DNA strengja, allt endar með núkleótíðinu sem var dídeoxý merkt fyrir þessi viðbrögð. Gel electrophoresis er síðan notað til að aðskilja strengina af fjórum viðbrögðum, í fjórum aðskildum brautum, og ákvarða röð upprunalegu sniðmátsins miðað við hvaða lengd strengja endar með hvaða núkleótíni.
Í sjálfvirkri Sanger-viðbrögðum eru prímar notaðir sem eru merktar með fjórum mismunandi lituðum flúrljómandi merkjum. PCR viðbrögð, í nærveru mismunandi dídeoxý núkleósíðanna, eru gerðar eins og lýst er hér að ofan. Hins vegar er síðan fjórum hvarfblöndur sameinuð og beitt á einum stíflan af hlaupi. Liturinn á hverju broti er greindur með leysigeisla og upplýsingarnar eru safnar með tölvu sem býr til litróf sem sýnir tindar fyrir hvern lit, sem hægt er að ákvarða DNA-röð fyrir sniðmát.
Venjulega er sjálfvirkur raðunaraðferð aðeins nákvæm fyrir raðir upp að hámarki um það bil 700-800 grunnpar á lengd. Hins vegar er hægt að fá fullt raðir af stærri genum og í raun heilum genum, með því að nota skref-vitur aðferðir eins og Primer Walking og Shotgun raðgreiningu.
Í Primer Walking er vinnanlegur hluti stærri gens raðað eftir því að nota Sanger aðferðina. Nýir grunnar eru myndaðir úr áreiðanlegum hluta röðarinnar og notaðir til að halda áfram að raða þeim hluta gensins sem var utan bilanna af upprunalegu viðbrögðum.
Shotgun raðgreining felur í sér handahófi að skera DNA hluti af áhuga í meira viðeigandi (viðráðanleg) stór brot, raða hvert brot, og raða stykki byggt á skarast raðir. Þessi tækni hefur verið auðveldara með því að beita tölvuforrit til að skipuleggja skarast stykki.